PCR儀，你真的選對了嗎？

　　Kary Mullis博士也許並沒有想到，他發明的PCR技術能夠在未來三十年保持長盛不衰。這不僅(jin) 要歸功於(yu) DNA聚合酶的發展，也要歸功於(yu) PCR儀(yi) 的不斷升級。如今，反應效率提高，反應體(ti) 積減少，使得PCR逐漸應用在更廣泛的領域。選購PCR儀(yi) ，似乎並不是一件難事。然而，對於(yu) 一些關(guan) 鍵的參數，你真的了解它們(men) 的意義(yi) 嗎?

　　快速變溫

　　現在，快速PCR已成為(wei) 一種潮流。反應時間從(cong) 90分鍾縮短到30分鍾，是受歡迎的，畢竟誰也不想在預約PCR儀(yi) 時排隊等太久。溫度循環是所有PCR的基礎。儀(yi) 器的變溫速率將決(jue) 定PCR運行的整體(ti) 速度。毫無疑問，變溫越快，PCR運行也越快。宣傳(chuan) 資料往往也會(hui) 首先展示zui高變溫速率以暗示PCR儀(yi) 運行速度更快。因此，在拿到參數表時，我們(men) *時間會(hui) 留意變溫速率，也就是升降溫速率。

　　不過，如果大家留心看，通常會(hui) 發現ramp rate前麵還會(hui) 有一個(ge) Max，這說明製造商公布的是zui大變溫速率。zui大模塊變溫速率(maximum block ramp rate)表示模塊變溫速率的極限峰值。在PCR運行過程中，上述zui大性能隻在極短的時間內(nei) 可達到，那種掐著秒表來計算變溫速率的方法是不可取的。因此有誠意的製造商還會(hui) 公布平均模塊變溫速率(average block ramp rate)，表示在較長的變溫範圍內(nei) 溫度變化的速率。這個(ge) 參數沒那麽(me) 炫目，但更具參考意義(yi) ，具有比較價(jia) 值。

　　當然，樣品的變溫速率可沒有模塊那麽(me) 高。這就好比在爐子上燒水，爐子很快就達到100oC以上，但水可能隻有50oC。模塊的熱量傳(chuan) 遞到樣品還需要一定的滯後時間。因此，隻根據模塊溫度編程而不考慮樣品體(ti) 積的變溫速率並不能算準確。Applied Biosesystems在這一點上就很周道，提供了另一種參數，平均樣本變溫速率(average sample ramp rate)或者zui大樣品變溫速率(maximum sample ramp rate)。這個(ge) 參數能反應儀(yi) 器根據體(ti) 積來控製樣品達到設置溫度、遵循預設的實驗方案運行的真實能力，更有效地評估PCR儀(yi) 的真實性能。

　　以Applied Biosesystems ProFlex? PCR係統為(wei) 例，96孔和全新3x32孔模塊的zui大變溫速率達到6.0oC/秒，而標示樣品的zui大變溫速率也達到4.4oC/秒(1 μl樣品體(ti) 積)。配合快速PCR試劑，擴增500 bp的片段，不到半小時即可完成。它采用溫度控製算法將樣本體(ti) 積及反應管的厚度考慮在內(nei) ，其實際模塊溫度高於(yu) 設置點，從(cong) 而使滯後的樣本溫度能夠更快地達到設置點(又稱為(wei) 模塊熱過衝(chong) )。算法要才可根據不同體(ti) 積使樣本達到穩定的設置點溫度且無過衝(chong) 及相關(guan) 的負麵效應。

　　溫控準確

　　對於(yu) PCR反應而言，zui重要的莫過於(yu) 溫度控製的準確性。由於(yu) PCR是一個(ge) 幾何級數擴增的過程，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控製溫度，對退火而言溫控顯得尤為(wei) 重要。有時，退火溫度相差1oC，就能帶來迥然不同的結果。目前，市場上的大多數PCR儀(yi) 采用Peliter元件加熱，溫度準確性在±0.2oC左右。

　　溫度控製算法的性無疑會(hui) 影響溫度控製的。前麵提到的模塊熱過衝(chong) ，需要非常豐(feng) 富的經驗，的算法才可使不同體(ti) 積的樣本達到穩定的設置點溫度且無過衝(chong) 及相關(guan) 的負麵效應。

　　對於(yu) 96孔板PCR儀(yi) 來說，另一個(ge) 重要的參數是溫度均一性，這指的是各孔之間的溫度差異。均勻擴增反應板各孔的能力至關(guan) 重要，在實驗設計時常常被忽略。如果孔間的溫度條件不一致，那麽(me) 我們(men) 自然無法通過比較兩(liang) 個(ge) 不同位置的反應孔數據，而得到可靠的結論。大多數儀(yi) 器的溫度均一性在±0.3到±0.5oC之間。比如，Eppendorf的Mastercycler Pro S，在20-72oC時，均一性≤ ±0.3oC，在95oC，均一性≤ ±0.4oC。

　　對於(yu) 梯度PCR而言，溫度準確性的要求似乎更高。梯度PCR儀(yi) zui先由Eppendorf公司在1998年研發成功推向市場(Mastercycler Gradient)。通過設置一係列的梯度退火溫度進行擴增，從(cong) 而一次反應就可以篩選出的退火溫度，優(you) 化實驗，在節約成本的同時也節約了時間。

　　傳(chuan) 統的梯度PCR儀(yi) 的加熱模塊由分別控溫的2個(ge) Peltier元件組成，對它們(men) 設置不同的溫度，通過熱傳(chuan) 導可形成溫度梯度。不過，由於(yu) 均勻的金屬加熱模塊兩(liang) 端設置的高溫和低溫之間的熱學相互作用，無法實現真正的線性梯度。實際上，均勻的金屬加熱模塊上的溫度更多呈S形曲線而非線性梯度，列間的溫度差異不一致使其難以確定優(you) 化後的真實退火溫度，尤其是在優(you) 化難以處理的試驗時。

　　Applied Biosesystems在這方麵就有獨到的設計，它的VeriFlex加熱模塊有zui多有6個(ge) 獨立的加熱/冷卻模塊，由溫度控製器單獨控製。各個(ge) Peltier模塊之間用隔熱材料進行物理隔離，使得相鄰的Peltier模塊間的溫度幹擾zui小化，溫度控製更加。VeriFlex技術可以在金屬加熱模塊上模擬真正的線性溫度斜率。而且梯度模式和普通模式下升降溫的速率一致，確保優(you) 化的PCR反應條件在隨後的日常運行中也表現出一致的結果。

　　研究人員的另一個(ge) 噩夢是PCR反應會(hui) 蒸發。這種蒸發現象使PCR反應體(ti) 係中各組分濃度升高，特別是引物濃度升高，直接導致非特異性擴增。Eppendorf Mastercycler pro 梯度PCR儀(yi) 則采用vapo.protect技術，防止PCR反應體(ti) 係的蒸發。vapo.protect 熱蓋利用一塊軟墊覆蓋PCR耗材，各種不同形狀的PCR耗材都能實現覆蓋。這種技術提高了結果的重複性，是小體(ti) 積擴增的理想之選。Applied Biosesystems則是通過熱蓋的自動調節和凹形設計確保PCR管的密封，基本上市場麵上常見的PCR耗材都可以使用。當然，通常廠家會(hui) 建議使用Applied Biosesystems自己的PCR耗材，畢竟是經過廠家多重測試的，肯定也不會(hui) 錯。

　　靈活更換

　　雖說PCR儀(yi) 已逐漸設計成個(ge) 人化的儀(yi) 器，但真的是實驗室中人手一台，顯然並不太實際。實驗室中通常有多個(ge) 課題，每個(ge) 人的應用也各不相同，因此PCR儀(yi) 能滿足不同的需求。96孔模塊是大多數人的選擇，但未來有什麽(me) 樣的需求，當下並不清楚。抱著開放的心態，選擇一台靈活的PCR儀(yi) ，也許是明智的。

　　許多PCR儀(yi) 都允許更換樣品模塊，包括96孔、雙48孔和384孔等。對於(yu) 有些儀(yi) 器，各個(ge) 模塊之間是獨立的，就像多台PCR儀(yi) 一樣，可設置不同的運行程序。比如，Applied Biosesystems的ProFlex PCR係統就提供3 x 32孔獨立模塊，允許同時運行3組實驗，每組*獨立，互不幹擾。這種設計提高了效率，讓苦苦等待成為(wei) 過去。另外，除了標準的96孔模塊，它還提供雙96孔和雙384孔模塊，滿足高通量的測序需要。此外還有雙槽式模塊可供選擇，支持QuantStudio 3D數字PCR係統使用的芯片

　　Bio-Rad的C1000 Touch PCR儀(yi) 也提供4個(ge) 可互換的模塊，包括96孔、96深孔、48孔和384孔。96深孔模塊可容納0.2或0.5 ml PCR反應管，使反應體(ti) 積zui高可達125 μl。這種大的反應體(ti) 積適合新一代測序或芯片的樣品製備。

　　美好體(ti) 驗

　　性能要，操作可得簡單，這也是PCR儀(yi) 選購時一個(ge) 重要的考慮因素。畢竟，實驗室裏用戶的水平參差不齊，既有經驗豐(feng) 富的老手，也有剛剛入門的新手。操作直觀、輕鬆編程，相信是每個(ge) 人的願望。

　　幸運的是，如今的製造商在設計時都考慮到這一點，紛紛采用碩大的觸摸屏。有些人可能還不太習(xi) 慣，但大多數人享受著這種隨便點點就能設置好程序的過程。之前，Veriti PCR儀(yi) 作為(wei) 市場上*款觸摸屏PCR儀(yi) ，在推出時就受到很多客戶的歡迎。斯坦福大學的博士後Hugo Hilton曾表示：“觸摸屏顯示很直觀，讓用戶對反應過程一目了然。"隨後Bio-Rad也相繼推出了C1000和T100觸摸型PCR儀(yi) 。隨著觸摸屏技術的快速發展，越來越靈敏、能快速反應的PCR儀(yi) 也隨之產(chan) 生，比如Applied Biosesystems的ProFlex和SimpliAmp，那感覺和ipads是一樣一樣的。

　　遠程訪問也增強了用戶體(ti) 驗，它讓用戶能夠通過智能手機或平板電腦，調整操作並查看初步結果。在使用ProFlex PCR係統時，你就能通過免費的My ProFlex手機客戶端，從(cong) 你的辦公室、會(hui) 議室、家裏，甚至其他任何地方進行遠程連接，查看PCR實驗的運行情況，或查看哪個(ge) 模塊可以使用。

　　隨著PCR的應用越來越廣泛，人們(men) 也希望將PCR儀(yi) 帶出實驗室，帶到診所和田間。一些製造商也推出了便攜的PCR儀(yi) ，如Ahram Biosesystems。不過，在大多數情況下，儀(yi) 器還是擺在擁擠的實驗台上。而且，一些必要的組件是不可少的，比如加熱元件、電源等。因此，高性能的PCR儀(yi) 還是占有一定的體(ti) 積。不過，如今連測序儀(yi) 都跟U盤一般大了，還有什麽(me) 是不可能的呢。

　　過去三十年，PCR已經帶給了我們(men) 很多的驚喜。未來，儀(yi) 器性能會(hui) 更高，操作會(hui) 更簡便，功能會(hui) 更多樣，隻是，選擇會(hui) 更困難。擦亮雙眼，看看你真的需要什麽(me) ，再做決(jue) 定吧。