新一代測序在農業領域大放光彩

導讀：普通農(nong) 夫的穀倉(cang) 裏肯定沒有款的HiSeq測序係統。不過，這並不意味著新一代測序(NGS)在農(nong) 業(ye) 領域就不如醫學領域那麽(me) 重要。

　　喬(qiao) 治亞(ya) 大學的特聘教授Andrew Paterson就利用NGS來捕獲群體(ti) 的多樣性，他將基因型與(yu) 參考基因組進行比較。他領導的植物基因組作圖實驗室也利用NGS從(cong) 不同個(ge) 體(ti) 中獲得許許多多的許可，“這樣我們(men) 可以了解誰和誰關(guan) 係比較近”。

　　不管是研究玉米，還是研究小鼠，傳(chuan) 統的遺傳(chuan) 學、分子生物學和生物化學、生物信息學以及其他學科中的許多技術都是一樣的。然而，植物為(wei) 研究人員帶來了一些*的挑戰和機遇。

　　多倍體(ti)

　　植物可能攜帶了基因組的多個(ge) 拷貝，比如說，麵包小麥是六倍體(ti) ，而甘蔗的拷貝數多達200個(ge) 。“即使是四倍體(ti) ，我們(men) 都很少有高質量的參考序列，更不用說六倍體(ti) 了，”HudsonAlpha生物技術研究所的Jeremy Schmutz談道。誠然，亞(ya) 基因組之間有足夠的差異，讓你將大多數基因與(yu) 每條染色體(ti) 的不同特點相關(guan) 聯，但並非全部。Schmutz說，有很多東(dong) 西，你無法說出它們(men) 從(cong) 哪裏來，到哪裏去，因為(wei) 有太多的拷貝。甘蔗就更不用說了。

　　通常情況下，人們(men) 對親(qin) 本或祖先種或者模式生物開展遺傳(chuan) 學和基因組學分析。短柄草(Brachypodium)的基因組就特別小;它常作為(wei) 小麥或其他草類的替身。“重測序小麥可能需要Illumina HiSeq X Ten的半個(ge) 流動槽，這相當於(yu) 5個(ge) 人類基因組。而短柄草隻有350 Mb，因此你可以盡情測序，”Schmutz說。你可以誘導突變，測定表型，如果你發現了一些有趣的，可以看看小麥中的相同基因做了什麽(me) 。

　　參考呢

　　目前zui的植物基因組是水稻基因組，這主要是因為(wei) “我們(men) 使用了非常非常小心的BAC-by-BAC方法。我們(men) 利用Sanger測序對每個(ge) BAC(細菌人工染色體(ti) )進行單獨測序，”亞(ya) 利桑那基因組研究所的Rod Wing教授談道。這個(ge) 基因組於(yu) 2005年發表。

　　Wing還參與(yu) 了玉米基因組的測序，這也是通過BAC-by-BAC開展的。不過那時，“我們(men) 沒有足夠的資金來完成每個(ge) BAC，因此*完成的是真正的基因部分，”Wing解釋道。zui近，人們(men) 利用短讀取技術測序了基因組，產(chan) 生了缺乏大部分非編碼區域的基因組組裝。

　　NGS的zui大問題之一是短讀取無法很好地對付重複片段，這可能占了基因組的一半。現在有一種技術能夠很好地應對，南伊利諾伊大學的David Lightfoot教授談道，那就是PacBio的長讀取技術，它往往能夠跨過重複區域。Lightfoot的研究團隊正準備發表橄欖樹基因組，這就是結合短讀取和長讀取測序的。

　　高分子量DNA

　　BAC、長讀取測序、mate­pair文庫構建，以及其他一些方法，都需要相對高分子量的DNA。“對於(yu) 血液樣本而言，這很容易獲得，但是對植物來說有點難，因為(wei) 它們(men) 積累了碳水化合物以及其他的代謝產(chan) 物，可能降解DNA，”Schmutz說。此外，葉綠體(ti) 可能貢獻了10% 的DNA。去除它們(men) ，“這樣你就不會(hui) 一而再、再而三地把錢浪費在葉綠體(ti) 的重測序上，”Lightfoot說。他使用了各種方法，包括在黑暗中育苗(這也能去除澱粉)，從(cong) 根部取樣，或者使用現成的試劑盒來分離細胞核。

　　Wing的團隊不依賴試劑盒，而是裂解並離心細胞，然後用溫和的去汙劑(如Triton™ X­100)重懸沉澱，裂解葉綠體(ti) 和線粒體(ti) ，但保持細胞核完整。“然後你就可以取出細胞核，純化出高分子量的DNA，用於(yu) PacBio或長讀取測序，”他說。為(wei) 了製備BAC文庫，他的團隊將DNA嵌入低熔點瓊脂糖中，創造出DNA多孔袋，讓純化DNA的酶和試劑可在其中擴散。DNA則永遠不會(hui) 受到任何剪切力。

　　新應用

　　目前，植物基因組學中的大部分經費都用來生成參考基因組。下一步是尋找作物的多樣性，並查看它們(men) 的野生親(qin) 緣種。“在馴化過程中，你可能經曆了消除所有變異的過程，不過事實證明，這種變異有望解決(jue) 許多的農(nong) 業(ye) 問題，”Wing說。密歇根州立大學的Rebecca Grumet教授及其團隊正在尋找葫蘆科的抗病遺傳(chuan) 標記(QTL)，特別是西瓜、甜瓜、黃瓜和南瓜，這zui終將幫助育種者輕鬆篩查抗病品種。遺傳(chuan) 標記能幫助育種者混合多個(ge) 性狀，抵抗多種疾病，還能帶來其他的優(you) 良性狀。

　　她的團隊是利用兩(liang) 種測序法基因分型(GBS)來實現的。*種是基於(yu) 雙親(qin) 交配：將抗病株與(yu) 敏感株雜交，查看後代。它們(men) 都有全基因組參考序列，因此能夠找出性狀所在的位置。第二種是GWAS：他們(men) 計劃對每種作物的1000個(ge) 種質資源進行測序，特別是它起源的區域。他們(men) 將利用這些信息來了解多少遺傳(chuan) 多樣性是來自那裏，並建立核心種質。

　　此外，許多其他的NGS技術，比如RNA­Seq，也將在植物學研究中大顯身手。如今測序已經紮下了根，而隨著成本繼續下降，新一代的研究人員更加熟練，它的應用必將開花結果。

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