用二維碼構建“DNA編碼庫”，DNA標簽成藥物研發支柱

　　導讀：藥物研發一直是個(ge) 繁瑣的過程，化學家們(men) 需要篩選千百種化學分子，才可能找出有效的藥物。DNA技術可以大大加快這一過程。過去幾年來，藥物化學家通過用DNA標記化學分子，形成分子的二維碼，從(cong) 而提高藥物研發成功率。

　　麻省沃爾瑟姆市(Waltham, Massachusetts)的一座鋼筋混泥土建築的二樓，一個(ge) 實驗室冰箱裏的塑料盒中，包含著無數種化學分子。這些分子是葛蘭(lan) 素史克製藥公司(GlaxoSmithKline，GSK)合成的帶DNA標簽的分子，數目達到萬(wan) 億(yi) 種——這是銀河係恒星數目的10倍。

　　各大製藥公司和生物工程公司都在采用這種DNA編碼分子庫來迅速篩選能與(yu) 疾病相關(guan) 蛋白結合的分子，尤其是能與(yu) 那些目前難以靶向的蛋白結合的藥物。這種篩選方法比傳(chuan) 統篩藥方式更迅速，更便宜。基礎科學研究者也可以使用這種方法來探索基本生物學問題，研究酶、受體(ti) 和細胞通路。

　　藥物研發的起始步驟往往是：研究人員合成大量化學分子，然後測試這些分子對目標蛋白的結合作用。在多孔板的每個(ge) 孔裏加入目標蛋白，然後分別加入各種藥物分子，檢測這些分子對蛋白活力的影響。這種方法被稱為(wei) 高通量篩選(high-throughout screening，HTS)，主要使用機器自動測試上百萬(wan) 種化學分子，但仍然耗時耗力還費錢，而且不一定湊效。

　　過去幾年來，藥物化學家通過用DNA標記化學分子，形成分子的二維碼，從(cong) 而提高藥物研發成功率。這些DNA編碼分子庫具有諸多優(you) 點：首先，研究者並不需要單獨測試每種分子;而是隻需把分子分成各種混合物，然後檢測混合物是否對目標蛋白活性有影響。一旦有分子能與(yu) 目標蛋白結合，它就很容易被認出來——因為(wei) 可以檢測它的DNA二維碼。

　　1992年斯克裏普斯研究所(Scripps Research Institute)的分子生物學家Sydney Brenner 和化學家 Richard Lerner提出DNA編碼分子庫這一概念。此後，DNA編碼分子庫一直發展迅猛。2007年，GSK公司以5500萬(wan) 美金收購了一家在DNA標簽分子庫研究站處於(yu) 地位的公司。瑞士巴塞爾的諾華公司和羅氏公司也建立了內(nei) 部DNA標簽分子庫研究項目。多家新興(xing) 生物科技公司——包括沃爾瑟姆的X-chem、哥本哈根的Vipergen、劍橋的Ensemble製藥公司和瑞士的Philochem——也和學界和工業(ye) 界合作，迫切希望使用該技術。

　　“人們(men) 現在明白了，DNA編碼分子庫不是一種時尚，而是可以實現的。” 波士頓阿斯利康公司(X-Chem公司的合作者之一)化學創新中心的執行理事Robert Goodnow這樣說到。

　　DNA編碼分子庫不會(hui) 取代高通量篩選：由於(yu) 一些化合物不能使用DNA編碼技術合成，各大公司已在高通量篩選上投入巨資。但DNA編碼分子庫提供了一個(ge) 快速有效、低成本的互補方案，幫助尋找與(yu) 新的或具有挑戰性的目標蛋白結合的分子。例如，尋找泛素連接酶——一種將泛素分子連接到目標蛋白的酶、可作為(wei) 癌症治療的靶向分子——的結合分子。

圖：建立DNA二維碼

　　大即是美

　　GSK目前擁有世界上zui大的DNA編碼分子庫：GSK的高通量篩選庫有200萬(wan) 種分子，而DNA編碼分子庫有1萬(wan) 億(yi) 種分子，是高通量篩選庫的50萬(wan) 倍。

　　建立DNA編碼庫有幾種方式：zui大的分子庫，如GSK公司，使用 DNA記錄法(圖：建立DNA二維碼)。首先合成化學構建模塊，如氨基酸、胺和羧酸，然後通過化學反應，為(wei) 它們(men) 添加不同的DNA二維碼。將第二個(ge) 建構模塊加入到混合物中，形成新的小分子，DNA標簽延長。通過連接4個(ge) 構建模塊，化學家可創造藥物分子。由於(yu) 建築模塊的種類有上千種，因此潛在的組合數目非常巨大。

　　與(yu) 傳(chuan) 統高通量篩選相比，化學家必須單獨對每個(ge) 化合物進行檢測，而DNA編碼庫更易於(yu) 維護和使用。DNA編碼庫可以存儲(chu) 在一個(ge) 單一測試管中，而高通量篩選需要使用機器人把每個(ge) 分子單獨放到一個(ge) 測試管中。

　　但GSK的Chris Arico-Muendel表示，DNA編碼庫zui大的優(you) 點，是可合成的分子數量多。對於(yu) 新或難的目標蛋白，GSK使用DNA編碼庫和高通量篩選的頻率相同，甚至更高。迄今為(wei) 止，GSK公司使用DNA編碼技術合成的化合物是GSK2256294，能有效阻斷環氧化物酶，一種參與(yu) 脂肪分解的酶。該候選藥物是Praecis和GSK的合作成果，已通過1期臨(lin) 床安全實驗，將進一步評估其在糖尿病、傷(shang) 口愈合和慢性阻塞性肺病的治療中的效果。Arico-Muendel表示，他們(men) 很高興(xing) ，GSK的DNA編碼庫能發展這麽(me) 順利。

　　隨著化學構建模塊的增多，以及連接方式的增多，DNA編碼庫還會(hui) 進一步擴大。

　　X-Chem執行官Richard Wagner則認為(wei) ，在不久的將來，DNA編碼庫不僅(jin) 變得更大，也能更快進入臨(lin) 床。傳(chuan) 統的藥物篩選中，藥物化學家有時要花許多年來調整化合物結構，讓它們(men) 更特異、強效和安全。Wagner表示，可以說，傳(chuan) 統篩藥隻是一場概率遊戲。相比之下，基因編碼庫的大尺寸意味著，按照概率計算，一些化合物更易進入臨(lin) 床。盡管這些化合物仍然需要優(you) 化，但更接近理想分子，需要調整的幅度更小。

　　X-Chem的DNA編碼庫有1200億(yi) 種化合物，並已開始進行實踐。僅(jin) 僅(jin) 過了一年，他們(men) 就篩選出了候選藥物——一種autotaxin抑製劑，能阻斷一種磷脂轉化成另一種磷脂。X-Chem的子公司X-Rx現在計劃在2017年開始纖維變性藥物的臨(lin) 床試驗。業(ye) 界對X-Chem的DNA編碼分子庫的興(xing) 趣日益高漲：在過去五年中，該公司已與(yu) 幾大製藥*，包括羅氏、阿斯利康、拜耳、強生、輝瑞、賽諾菲等簽署合作協議，此外還和多個(ge) 生物工程公司和學術實驗室建立合作。

　　定製合成

　　其他生物公司則采用另一種方法合成分子庫。他們(men) 不僅(jin) 使用DNA標簽來標記分子，也使用DNA標簽作為(wei) 合成模板。哈佛大學(Harvard University)的化學家David Liu和他的學生開發了一種DNA模板法，產(chan) 生環形分子庫。環狀分子更大、更穩定，能在多個(ge) 位點與(yu) 目標分子結合，增強結合反應的特異性。(GSK和X-Chem公司都有很大的DNA編碼環形分子庫。)

圖為(wei) Sydney Brenner，與(yu) Richard Lerner在1992年提出DNA編碼分子庫的概念。

　　Liu首先產(chan) 生單鏈DNA模板，模板包含與(yu) 化學構建模塊的DNA標簽互補的序列。然後依次往化學反應容器中加入DNA標記的化學構建模塊，依靠DNA堿基配對，使各個(ge) 構建模塊的DNA標簽與(yu) DNA模板結合。zui後的反應是將各個(ge) 化學構建模塊連接成環狀，產(chan) 生環形分子和一個(ge) 長鏈DNA標簽。

　　構建DNA模板庫需要大量工作，因為(wei) 研究人員必須為(wei) 每個(ge) 分子設計模板，還需要為(wei) 成千上萬(wan) 種化學構建模塊設計DNA標簽。因此，DNA模板法產(chan) 生的分子庫小於(yu) DNA記錄法產(chan) 生的分子庫，但依舊遠大於(yu) 高通量篩選庫，並且還擁有其他優(you) 點。在DNA模板法中，科學家們(men) 一開始就知道zui終合成的分子有哪些，他們(men) 可以純化分子庫，去掉那些標簽錯誤的分子。這增加了篩藥的成功率。相比之下，巨大的DNA記錄分子庫可能仍然包含標簽錯誤的化合物。萬(wan) 一標簽錯誤的分子與(yu) 目標蛋白結合，研究者們(men) 就需要浪費大段時間在糾錯上。

　　Liu的分子庫包含14000種分子，目前已取得一些成功。2014年，他的團隊報道，他們(men) 發現了一種穩定的、特異的胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme, IDE，與(yu) 2型糖尿病有關(guan) )小分子抑製劑，在此之前，研究者們(men) 花了幾十年尋找和設計IDE抑製劑。Liu等人開始研究IDE在健康和疾病中的作用，幫助尋找其它IDE抑製劑。目前他們(men) 正努力把小分子抑製劑轉化成臨(lin) 床藥物。

　　Liu也篩選了100多種目標蛋白的抑製劑。這些蛋白大多急需小分子抑製劑，來促進相關(guan) 領域的研究。“我沒有想到，*代分子庫在7年後的今天，仍然能為(wei) 我們(men) 帶來這麽(me) 多科學發現。在篩選抑製劑上，我們(men) 成果累累。到現在為(wei) 止，我們(men) 發現了非常多種分子的抑製劑，數目多到我們(men) 無法一一研究。”

　　盡管如此，Liu仍然不懈發展第二代DNA模板分子庫，這個(ge) 分子庫包含256000個(ge) 環形分子。Liu在2004年創立了Ensemble Therapeutics公司，該公司的分子庫現在已有1000萬(wan) 個(ge) 分子。公司聚焦於(yu) 尋找免疫檢查點蛋白的抑製劑，調節免疫係統和泛素連接酶。他還授權給諾華公司，開發靶向炎症相關(guan) 蛋白白細胞介素-17的藥物。

　　快速篩選

　　一旦分子庫建立成功，就開始了目標蛋白結合分子的尋找之旅。大多數研究人員依靠“親(qin) 和篩選”來找出這些化合物。為(wei) 此，他們(men) 為(wei) 靶蛋白添加純化標簽，使用純化標簽把結合了分子的蛋白提取出來。zui後一步是讀取DNA標簽，鑒別與(yu) 蛋白結合的小分子。

　　這種方法的一個(ge) 優(you) 點是，僅(jin) 需一點點目標蛋白，就能得到結果。在一個(ge) 項目中，Arico-Muendel想尋找一種不穩定的、獲取量很少的蛋白的結合分子。他說，“把蛋白放在幹冰上後，我們(men) 很快完成了整個(ge) 篩選過程。而且我們(men) 找到了一些能與(yu) 該蛋白結合的分子。”高通量篩選是無法完成這種這類實驗。因為(wei) 高通量篩選裏，目標蛋白必須穩定且足量，且要在實驗開始前往千百個(ge) 孔裏加入目標蛋白。

　　但親(qin) 和篩選也有其不足。笨重的DNA標簽有時會(hui) 阻礙分子與(yu) 目標蛋白的互動，因此一些有效的分子可能被遺漏。但由於(yu) DNA編碼庫太大，研究者們(men) 通常不太在意這些損失。更大的問題是，小分子和標簽可以結合到純化柱上，產(chan) 生假陽性率。純化標簽也會(hui) 影響目標蛋白的結構，引入數據誤差。

　　幾個(ge) 研究小組已經找到了解決(jue) 之道。Vipergen，一家擁有5000萬(wan) 個(ge) 分子的DNA模板庫的生物技術公司，采用“粘合劑陷阱”來解決(jue) 這個(ge) 問題。

　　Vipergen公司的執行官Nils Hansen表示，你可以凍結你的蛋白——分子庫混合物，切割成非常小的冰塊。如果冰塊足夠小，每個(ge) 冰塊隻包含一個(ge) 靶蛋白。在這個(ge) 尺度上，即使沒有純化，與(yu) 該靶蛋白結合的小分子的比例也會(hui) 增加。Vipergen在水和油乳劑中完成篩選，也能達到同樣的效果。此時，微小的水滴的效果等同於(yu) 小冰塊。Hansen感慨，“這超酷!”

　　目前，DNA編碼分子庫用於(yu) 篩選可溶於(yu) 水、自由浮動的蛋白的抑製劑。但很多重要的藥物靶點嵌於(yu) 細胞表麵，因此不可能使用傳(chuan) 統的親(qin) 和篩選法。例如，大約40%的經認證藥物的靶點都是細胞膜上感受胞外刺激的G蛋白偶聯受體(ti) 。Goodnow指出，膜結合蛋白的篩選技術在不斷發展，“但仍然不夠完善”。

　　一種解決(jue) 方法是混合DNA編碼分子庫與(yu) 過表達膜結合蛋白靶標的完整細胞。小分子可以與(yu) 細胞表麵的目標蛋白結合。然後，研究者洗去未發生結合的分子，加熱細胞，讀取DNA標簽，鑒定有效的小分子。GSK已經用這種方法來確定一個(ge) 受體(ti) ——該受體(ti) 在精神分裂症和中樞神經係統疾病中起重要作用的強效抑製劑。

　　X-Chem也在膜結合蛋白藥物篩選中獲得成功。Wagner說，“以前，我們(men) 主要篩選可溶性蛋白的抑製劑。但數據顯示，我們(men) 現在也能篩選相對困難的膜結合蛋白的抑製劑。” Wagner補充說，隨著DNA編碼庫的不斷擴大，以及新的篩選方法的問世，“DNA編碼庫將成為(wei) 醫藥行業(ye) 藥物研發的支柱之一。”

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